Metagenómica y aprendizaje automático.

Comunicaciones ISME volumen 3, Número de artículo: 14 (2023) Citar este artículo

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El desarrollo de cultivares de arroz con bajo contenido de cadmio (Cd) ha surgido como una vía prometedora para la seguridad alimentaria en tierras agrícolas contaminadas con Cd. Se ha demostrado que los microbiomas del arroz asociados a las raíces mejoran el crecimiento del arroz y alivian el estrés por cadmio. Sin embargo, los mecanismos de resistencia al Cd específicos del taxón microbiano que subyacen a las diferentes características de acumulación de Cd entre diferentes cultivares de arroz siguen siendo en gran medida desconocidos. Este estudio comparó el cultivar XS14 con bajo contenido de cadmio y el cultivar de arroz híbrido YY17 en cuanto a la acumulación de cadmio con cinco enmiendas del suelo. Los resultados mostraron que XS14 se caracterizaba por estructuras comunitarias más variables y redes de coocurrencia estables en el continuo suelo-raíz en comparación con YY17. Los procesos estocásticos más fuertes en el ensamblaje de la comunidad de rizosfera XS14 (~25%) que los de YY17 (~12%) sugirieron que XS14 puede tener una mayor resistencia a los cambios en las propiedades del suelo. Las redes de coocurrencia microbiana y los modelos de aprendizaje automático identificaron conjuntamente la microbiota indicadora clave, como Desulfobacteria en XS14 y Nitrospiraceae en YY17. Mientras tanto, se observaron genes implicados en el ciclo del azufre y el ciclo del nitrógeno entre el microbioma asociado a las raíces de estos dos cultivares, respectivamente. Los microbiomas en la rizosfera y la raíz de XS14 mostraron una mayor diversidad en el funcionamiento, con un enriquecimiento significativo de genes funcionales relacionados con el transporte y el metabolismo de aminoácidos y carbohidratos, y el ciclo del azufre. Nuestros hallazgos revelaron diferencias y similitudes en las comunidades microbianas asociadas con dos cultivares de arroz, así como biomarcadores bacterianos que predicen la capacidad de acumulación de Cd. Por lo tanto, proporcionamos nuevos conocimientos sobre las estrategias de reclutamiento específicas de taxones de dos cultivares de arroz bajo estrés por Cd y destacamos la utilidad de los biomarcadores para ofrecer pistas para mejorar la resiliencia de los cultivos al estrés por Cd en el futuro.

Comprender las características del microbioma asociado a las raíces es una prioridad de investigación emergente; Dicha información es de vital importancia para que comprendamos el profundo papel de los microbiomas en la promoción del crecimiento de los cultivos y la tolerancia al estrés ambiental [1,2,3]. Las composiciones y funciones de la comunidad microbiana asociada a las raíces de las plantas se diferencian en gran medida por los microhábitats y fenotipos de las raíces [4,5,6]. Estudios recientes han informado sobre el reclutamiento de nichos específicos y el enriquecimiento microbiano de funciones específicas que fueron desencadenados por las respuestas de los microbiomas de las raíces de las plantas a la perturbación ambiental [7,8,9]. Además, los cultivos hospedantes tienen efectos de selección sobre los microbiomas en nichos asociados a las raíces que podrían inducir la estructura comunitaria reestructurada y la transformación de los perfiles funcionales [10, 11]. A pesar del creciente reconocimiento de que la estructura y el funcionamiento de la comunidad de microbiomas asociados a las raíces pueden afectar el crecimiento de los cultivos bajo estrés abiótico, aprovechar el conocimiento del microbioma específico de cada cultivar para mejorar la resiliencia de los cultivos al estrés sigue siendo un desafío. Por lo tanto, revelar las distintas variaciones en las composiciones y funciones de los microbios en nichos asociados a las raíces con diferentes especies de cultivos o diferentes cultivares dentro de una especie es de gran importancia para utilizar los microbiomas de los cultivos para mejorar el rendimiento.

Con la creciente demanda de tierras agrícolas [12, 13], la contaminación por cadmio (Cd) de las tierras agrícolas y su acumulación en los cultivos se está convirtiendo en un grave problema ambiental global [14]. El arroz es uno de los alimentos básicos más importantes para el ser humano. Debido a la alta movilidad del Cd desde la raíz hasta el brote en el arroz, el consumo de productos de arroz contaminados con Cd representa una grave amenaza para la salud pública [15]. Para disminuir la acumulación de Cd en los granos de arroz, además de aplicar enmiendas al suelo para la inmovilización química in situ, se han empleado ampliamente otras medidas, como el cultivo de variedades de arroz con baja acumulación de Cd [16]. Mejorar la resistencia microbiana asociada a las raíces al estrés por Cd también podría reducir la acumulación de Cd en los granos de arroz, es decir, las comunidades microbianas podrían expresar funciones bajo niveles elevados de Cd, como la formación de biopelículas, la producción de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) y genes de resistencia a metales pesados. desarrollo de vías [17]. Las diferentes variedades de arroz tienen diferentes capacidades de absorción y acumulación de Cd [18, 19]. Cao et al. [20] revelaron que el arroz híbrido podría acumular una mayor concentración de Cd en los granos en comparación con el arroz convencional, y también se observaron hallazgos similares en dos tipos principales de arroz cultivado en Asia, el arroz indica y japónica [14]. Sin embargo, estos estudios se centraron en las variaciones en las acumulaciones de Cd de diferentes cultivares de arroz. Los resultados contrastantes podrían deberse a diversos factores bióticos y abióticos, como las enmiendas del suelo y el manejo de fertilizantes. Recientemente, se ha investigado ampliamente la importancia de los microbiomas asociados a las raíces de diferentes cultivares de arroz en el ciclo de nutrientes y la degradación de los contaminantes orgánicos del suelo [21, 22]. Sin embargo, todavía falta información sobre la diversidad de la comunidad microbiana asociada a las raíces y la diversidad de la comunidad. funciones de diferentes cultivares de arroz que exhiben rasgos contrastantes de acumulación de Cd.

Al plantar arroz en suelos contaminados con Cd, hay evidencia sustancial que sugiere que los patrones de las estructuras y funciones de la comunidad microbiana asociada a las raíces varían significativamente entre los cultivares de arroz con bajo contenido de Cd y los cultivares de arroz híbridos. Los taxones beneficiosos para las plantas, como Bacillus, Pseudomonas, Dyella y Rhizobium, están altamente enriquecidos en la rizosfera de cultivares de arroz con bajo contenido de cadmio [23]. Estos taxones clave desempeñan un papel esencial en el crecimiento de las plantas y la resistencia al Cd en la rizosfera [24, 25]. El ensamblaje de su comunidad microbiana se rige en gran medida por las interacciones entre los microbios, la planta huésped y el entorno del suelo [26]. Los conocimientos recientes sobre los patrones de ensamblaje en el continuo suelo-raíz pueden mejorar nuestra comprensión de la respuesta de la comunidad microbiana al cambio ambiental [27, 28]. Por lo tanto, explorar la formación y el mantenimiento de la asamblea comunitaria es crucial para predecir la variación de la comunidad microbiana en la taxonomía y el funcionamiento [29]. Sin embargo, el ensamblaje de la comunidad en el continuo suelo-raíz y el recambio de funciones microbianas bajo estrés por Cd no se comprenden completamente.

Recientemente, la secuenciación de alto rendimiento se ha utilizado ampliamente para estudiar los microbiomas de diferentes cultivos en respuesta al estrés ambiental [30, 31]. La combinación metagenómica puede describir la composición taxonómica y el potencial funcional de las comunidades microbianas con alta resolución taxonómica [32]. Este enfoque es de gran interés para los investigadores, ya que puede proporcionar conocimientos novedosos sobre los mecanismos de adaptación ecológica específicos y las funciones metabólicas de la microbiota que desempeñan papeles importantes en la tolerancia al estrés, como el cambio climático [8] y la contaminación por residuos [33, 34]. e invasión de patógenos del suelo [35, 36]. A pesar de esto, los datos del microbioma son más diversos y heterogéneos que otros tipos de datos, como las propiedades fisicoquímicas del suelo. Recientemente, el aprendizaje automático se ha convertido en una herramienta eficaz en la investigación genómica, ya que puede proporcionar información más profunda sobre datos de microbiomas dispersos y de alta dimensión [37, 38]. Statnikov et al. [39] compararon sistemáticamente 18 métodos principales de clasificación de aprendizaje automático utilizando conjuntos de datos de microbioma humano y descubrieron que el bosque aleatorio era el método de aprendizaje automático más eficaz. En la actualidad, los enfoques de aprendizaje automático también se aplican ampliamente para detectar la composición de la comunidad microbiana y el análisis de correlación funcional [40]. Por ejemplo, Zhang et al. [1] utilizó el enfoque de bosque aleatorio para predecir con precisión la microbiota de las raíces de las variedades índica y japónica e identificó 18 familias como microbios biomarcadores. Además, Yuan et al. [41] predijeron con precisión la aparición de marchitez por Fusarium del suelo utilizando enfoques de aprendizaje automático basados ​​en metadatos globales integrados de bacterias y hongos. Por lo tanto, los rápidos avances en la tecnología de secuenciación de ADN, junto con datos enriquecidos disponibles públicamente y enfoques emergentes de aprendizaje automático, brindan un enfoque prometedor para que los investigadores combinen datos de múltiples estudios para lograr conclusiones más sólidas.

Anteriormente, investigamos las variaciones en las concentraciones de Cd de diferentes cultivares de arroz y seleccionamos un cultivar con una acumulación de Cd notablemente baja (Xiushui14, XS14) de 10 cultivares probados (Fig. S1). Los resultados en diferentes niveles de Cd sugirieron que XS14 exhibió una menor acumulación de Cd en raíces y brotes en comparación con YY17 bajo diversos tratamientos de enmienda del suelo [42]. Teniendo estas ideas en mente, nuestro objetivo fue desentrañar las diferencias en el ensamblaje del microbioma asociado a las raíces y los atributos funcionales de dos cultivares de arroz (XS14 y YY17). Nuestra hipótesis es que existe un mecanismo microbiano específico de taxón que sustenta las diferencias en los mecanismos de resistencia al Cd entre dos cultivares de arroz. Para lograr esto, investigamos la comunidad bacteriana en el continuo suelo-raíz (Fig. 1a) y realizamos técnicas de aprendizaje automático para identificar taxones de biomarcadores de dos cultivares de arroz (Fig. 1b). También ensamblamos un metagenoma de escopeta para explorar los perfiles funcionales del microbioma en la rizosfera y la endosfera. Este trabajo no solo ha desarrollado una comprensión descriptiva de la microbiota asociada a las raíces, sino que también ha revelado mecanismos de adaptación específicos de taxones de dos cultivares de arroz bajo estrés por Cd basados ​​en análisis de secuenciación metagenómica y métodos de aprendizaje automático.

Método de muestreo y recolección de microbios en el suelo y en los compartimentos asociados a las raíces (a) y flujo de trabajo para la implementación de modelos de aprendizaje automático para predecir dos cultivares de arroz (b).

En este estudio, utilizamos cuatro enmiendas de suelo diferentes (cal, estiércol de cerdo, biocarbón y acondicionador de suelo comercial) para determinar si las características de acumulación de Cd variaban consistentemente entre dos cultivares de arroz bajo diferentes propiedades edáficas. La aplicación de enmiendas del suelo afectó significativamente las propiedades fisicoquímicas del suelo (p. ej., pH del suelo, nitrógeno nitrato, Cd disponible) de dos cultivares de arroz (Tablas S1, S2). Por ejemplo, las aplicaciones con diferentes enmiendas también tienen efectos significativos sobre las concentraciones de NH4+-N en el suelo de la rizosfera de YY17 (F4,10 = 6.38, P < 0.01) y XS14 (F4,10 = 3.59, P < 0.05). Como se esperaba, en comparación con YY17, la cantidad de concentraciones de Cd en los granos se redujo significativamente en XS14 (Fig. S2b), específicamente en tratamientos con biocarbón (BC, prueba t de Student: t = 5.401, df = 3.983, P <0.01), acondicionador comercial Mg-Ca-Si (CMC, prueba t de Student: t = 3,191, gl = 3,925, P < 0,05) y el control (CK, prueba t de Student: t = 3,058, gl = 3,469, P < 0,05). Mientras tanto, los valores de pH en suelos a granel y rizosféricos de XS14 fueron notablemente más altos que los del YY17 (p. ej., LM en suelo a granel, prueba t de Student: t = 3,027, df = 3,392, P <0,01; Fig. S2c; Tabla S2) , y XS14 tenía concentraciones más bajas de Cd disponible en suelos a granel y rizosféricos (p. ej., CMC en suelo a granel, prueba t de Student: t = 2,785, gl = 2,069, P < 0,05; PM en suelo rizosférico, prueba t de Student: t = 4,932, gl = 3,207, P <0,05; Fig. S2d; Tabla S2). Lo más importante es que encontramos que el factor de bioacumulación de YY17 es significativamente mayor que el de XS14 (prueba t de Student: t = 2,859, df = 20,25, P <0,01, Fig. S3). Esta sólida evidencia demostró que XS14 es un cultivar de arroz con bajo contenido de Cd en comparación con YY17. En conjunto, nuestros datos demuestran que las aplicaciones de enmiendas condujeron a los cambios correspondientes en las propiedades edáficas sembradas con dos cultivares de arroz y, lo que es más importante, las comparaciones entre dos cultivares de arroz mostraron que XS14 ejerció la menor capacidad de acumulación de Cd bajo todos los tipos de tratamientos de enmiendas del suelo.

Para caracterizar las variaciones en los procesos de ensamblaje de la microbiota asociada a las raíces de dos cultivares de arroz, analizamos los datos de secuenciación de 16 S de cuatro nichos asociados a las raíces. Después del filtrado, se obtuvieron 11.231.141 lecturas de alta calidad y estas lecturas se agruparon en 14.369 ASV según el método de agrupación DADA2. Para la diversidad alfa de dos tipos de arroz, no hubo diferencias generales en la diversidad de Shannon y el índice Chao 1 de la comunidad bacteriana en masa y endosfera entre XS14 y YY17. Sin embargo, las métricas de diversidad de Shannon revelaron valores significativamente más altos en la rizosfera de YY17 (prueba t de Student: t = 1,975, df = 15,034, P <0,05; Fig. 2a), en comparación con XS14, y el índice Chao 1 mostró la tendencia opuesta en el rizoplano. (Prueba t de Student: t = 2,011, gl = 27,79, P <0,05, Fig. 2a). Sorprendentemente, desde el suelo a granel hasta la endosfera, nuestros resultados mostraron una disminución gradual a lo largo del continuo suelo-raíz, ya sea para el índice de Shannon o Chao 1 (prueba de Kruskal-Wallis, P <0,001; Fig. 2a).

un índice de Shannon y Chao1 de la comunidad bacteriana en los cuatro nichos asociados a raíces de dos cultivares de arroz. La significación de la diferencia se determinó mediante la prueba de Kruskal-Wallis. b Análisis NMDS agrupado por cuatro nichos compartimentales basado en matrices de distancia de Bray-Curtis de comunidades bacterianas de dos cultivares de arroz. c La disimilitud microbiana de Bray-Curtis entre todas las muestras varió en cuatro nichos entre dos cultivares de arroz. En los paneles (b, c), los valores de R y P se evaluaron mediante la función Adonis en un paquete vegano. d Disimilitud comunitaria en cuatro nichos entre el cultivar XS14 con bajo contenido de Cd y el cultivar híbrido YY17. En los paneles (a, d), los asteriscos etiquetados implican la diferencia significativa (P <0,05) determinada por las pruebas t de Student. 'NS' no representa diferencias significativas. e Procesos deterministas y estocásticos en el ensamblaje bacteriano de dos cultivares de arroz entre cuatro nichos.

El escalamiento multidimensional no métrico (NMDS) basado en la distancia de Bray-Curtis mostró que la microbiota bacteriana formó dos grupos distintos según los cultivares entre cuatro nichos, siendo la explicación de los cultivares de arroz a las diferencias de la comunidad bacteriana entre los cuatro nichos 12, 14, 13. y 20%, respectivamente (Fig. 2b). Además, la microbiota bacteriana de dos cultivares de arroz formó cuatro grupos distintos según los nichos de las raíces (Fig. 2c). El análisis PERMANOVA sugirió que los nichos del compartimento (R2 = 0,59) también afectaron fuertemente las composiciones de la comunidad microbiana de todas las muestras, y afectaron fuertemente a XS14 (R2 = 0,61) y YY17 (R2 = 0,69) individualmente (Fig. 2c; Tabla S3). Las curvas de densidades de frecuencia mostraron que las muestras de cuatro nichos se diferenciaron principalmente por los primeros ejes NMDS para dos cultivares de arroz (Fig. 2c). Además, la disimilitud de la comunidad microbiana entre todas las muestras de XS14 fue mucho mayor que la de YY17 en diferentes nichos, excepto en el suelo en masa (prueba t de Student, suelo en masa: P = 0,197; rizosfera, rizoplano, endosfera: P <0,001, Fig. 2d ). En términos de composición de la comunidad, el filo dominante entre cuatro nichos de dos cultivares de arroz fue Proteobacteria, Chloroflexi y Acidobacteria, y las abundancias relativas de taxones bajo diferentes tratamientos también variaron entre dos cultivares de arroz (Fig. S4a). En particular, las diferencias en la composición de la comunidad microbiana fueron detectables a nivel familiar (Fig. S4b, c). Para dos cultivares de arroz, las familias pertenecían a Xanthobacteraceae (7,6–32,4%), Anaerolineaceae (10,2–23,1%), HOC36 (3,7–12,5%) y Bacillaceae (2,2–9,6%) fueron los taxones dominantes entre cuatro nichos, respectivamente ( Figura S4b). Además, algunas bacterias beneficiosas potenciales variaron significativamente entre dos cultivares de arroz en cuatro nichos (Fig. S4b, c). Por ejemplo, Pseudomonadaceae fue mucho más rica en suelo, rizosfera y rizoplano de XS14 (P < 0,05), Bacillaceae obviamente se enriqueció en rizoplano de YY17 (P < 0,001), mientras que Rhizobiaceae se localizó principalmente en la rizosfera de XS14 (P < 0,001). ).

El modelo SourceTracker mostró que las comunidades bacterianas de dos cultivares de arroz se derivaron principalmente de suelos a granel y se filtraron gradualmente en diferentes nichos del compartimento de las raíces (Fig. S5). Las comunidades bacterianas del suelo a granel fueron las fuentes más importantes de comunidades bacterianas de la rizosfera para dos cultivares de arroz, con contribuciones mayoritarias del 79,5 y 84,8% en XS14 y YY17, respectivamente. Rhizoplane seleccionó la mayoría de las especies de la rizosfera (79,1% en XS14 y 75,8% en YY17) y la minoría de especies del suelo a granel (8,4% en XS14 y 5,3% en YY17). Para dos cultivares de arroz, el rizoplano fue la principal fuente potencial de endosfera (Fig. S5).

Luego, se infirieron los mecanismos de asamblea comunitaria con el análisis del modelo nulo. Los resultados mostraron que la selección de variables pertenecientes a procesos deterministas fue el proceso crítico que impulsó el ensamblaje de la comunidad bacteriana (~78% para XS14 y ~82% para YY17) entre cuatro nichos asociados a raíces (Fig. 2e). Además, junto con el continuo suelo-raíz, se observó una mayor contribución relativa de la selección variable para el ensamblaje de comunidades bacterianas de XS14 (69~78%) e YY17 (77~80%), y ejerció un impacto más significativo en el ensamblaje de comunidades bacterianas. de YY17 que XS14. También notamos que los procesos estocásticos de XS14 en la rizosfera (~25%) contribuyeron más que YY17 (~12%). En conjunto, estos resultados sugieren que XS14 poseía conjuntos de comunidades bacterianas más distintas y variables que YY17. Las contribuciones más fuertes de los procesos estocásticos observadas en XS14 pueden indicar una mayor capacidad de la comunidad bacteriana de XS14 para adaptarse a los cambios en las condiciones del suelo.

Se utilizó un análisis de redes de coocurrencia basado en correlaciones significativas para comparar las diferencias de las interacciones microbianas entre dos cultivares de arroz en cuatro nichos de raíces. Las diferencias en las propiedades topológicas entre las redes empíricas y las redes aleatorias sugirieron que las redes microbianas empíricas en cuatro nichos no eran aleatorias (Tabla S4). De acuerdo con la diversidad alfa (Fig. 2a), notamos que la complejidad de la red disminuyó gradualmente, con el grado promedio más alto (7.503 en XS14 y 5.415 en YY17) para redes de comunidades de suelo a granel, y el grado promedio más bajo (7.503 en XS14 y 5.415 en YY17) para los de endosfera (Fig. 3a, b; Tabla S5). El análisis de redes de coocurrencia mostró que hubo un fuerte impacto del huésped en las redes de la comunidad bacteriana asociada a las raíces con una reducción pronunciada en el número de nodos y bordes de las redes desde el suelo a granel hasta la endosfera de las raíces (Fig. 3a; Tabla S5). Además, hubo más nodos y bordes, mayor grado promedio y coeficiente de agrupamiento promedio en las redes de XS14 en comparación con YY17 (Fig. 3b; Tabla S5). Más información sobre un análisis de conectividad natural mostró que la red XS14 es mucho más robusta y estable en suelos a granel y rizosféricos que la de YY17 (Fig. 3c).

a Análisis de red de coocurrencia de dos cultivares de arroz a lo largo del continuo suelo-planta. Los nodos representan ASV bacterianos dominantes (con abundancias relativas > 0,01%) que se muestran en diferentes colores. El tamaño de los nodos es proporcional al grado de taxones. b Parámetros topológicos de red para cuatro redes bacterianas de nichos asociados a raíces. c Robustez de las redes bacterianas en suelo a granel, rizosfera, rizoplano y endosfera de XS14 e YY17.

Con base en el análisis de conectividad dentro de los módulos (Zi) y entre módulos (Pi), evaluamos el papel topológico de los nodos individuales en las redes y definimos las especies clave en cada red de dos cultivares de arroz. La comparación de los concentradores de módulos demostró que XS14 tenía más concentradores de módulos (nodos altamente conectados a otros miembros en un módulo) entre cuatro nichos que YY17, con un total de 21 y 10 concentradores de módulos detectados en XS14 e YY17, respectivamente (Fig. S6 ; Tabla S6). Mientras tanto, el número de centros de módulos disminuyó desde el suelo a granel (12 y 6 centros de módulos en XS14 e YY17, respectivamente) a la endosfera (0 centros de módulos en XS14 e YY17), y la mayoría de los centros de módulos pertenecían al filo Proteobacteria, Actinobacteria. y Acidobacterias (Tabla S6). En conjunto, nuestro análisis de red sugiere una comunidad microbiana más estrechamente conectada y estable en el suelo y la rizosfera de XS14 en comparación con YY17.

Dadas las diferencias observadas en los conjuntos de comunidades bacterianas asociadas a las raíces entre dos cultivares de arroz (Fig. 2), exploramos más a fondo si los caracteres de las comunidades bacterianas asociadas a las raíces del arroz podrían usarse como biomarcadores para distinguir dos cultivares de arroz mediante la construcción de modelos de clasificación con máquinas. aprendiendo. Se utilizaron matrices de abundancias relativas a nivel de ASV entre cuatro nichos como entrada para el entrenamiento del modelo. Seleccionamos seis modelos y realizamos una validación cruzada quíntuple para verificar los modelos. Luego se eligió el mejor modelo basándose en las tasas de error promedio. Nuestros resultados mostraron que el bosque aleatorio tuvo la tasa de error promedio más baja en comparación con otros modelos, que es 0.068, 0.067, 0.017 y 0.015 en suelo, rizosfera, rizoplano y endosfera, respectivamente (Fig. S7). Por lo tanto, utilizamos además el modelo de bosque aleatorio para analizar la importancia de cada ASV. La matriz de confusión mostró que la precisión de predicción general del modelo de bosque aleatorio alcanzó el 94,1% (88,9% para XS14 y 100% para YY17), 88,2% (88,9% para XS14 y 87,5% para YY17), 94,1% (100% para XS14 y 90,9% para YY17) y 100% (100% para XS14 y 100% para YY17) en suelo a granel, rizosfera, rizoplano y endosfera, respectivamente (Fig. S8). Las curvas de error de validación cruzada entre cuatro nichos mostraron que el error de validación cruzada mínimo se obtuvo al utilizar los 8, 8, 12 y 9 ASV más relevantes, respectivamente (Fig. S9). Estos biomarcadores en cuatro nichos asociados a raíces con diferentes abundancias relativas predicen dos cultivares de arroz (Fig. 4). Nuestro resultado indicó que en el suelo a granel, Nitrospiraceae fue el ASV más importante y se enriqueció en muestras de YY17. Rhizobiaceae, Bacillaceae y Mycobacteriaceae fueron los ASV más importantes en la rizosfera, el rizoplano y la endosfera, respectivamente. Además, seleccionamos los 2 ASV de biomarcadores principales para explorar las relaciones entre la abundancia relativa de taxones de biomarcadores clave y las concentraciones de Cd en los granos de arroz. Específicamente, encontramos que las abundancias relativas (puntuación Z normalizada) de los 2 taxones de biomarcadores principales entre cuatro nichos se correlacionaron significativamente con las concentraciones de Cd en los granos de arroz (Fig. S10). Estos resultados indicaron que la microbiota que coloniza los nichos asociados a las raíces podría usarse como biomarcadores clave que hicieron contribuciones sustanciales a las variaciones en la capacidad de acumulación de Cd de dos cultivares de arroz.

Modelo de bosque aleatorio utilizado para excavar especies bacterianas que distinguen con precisión muestras de XS14 e YY17 entre nichos de suelo, rizosfera, rizoplano y endosfera. Los 10 ASV bacterianos indicadores principales en cada nicho se clasifican en orden descendente de valores de precisión de disminución media (MDA). El mapa de calor muestra las abundancias normalizadas de ASV bacterianos indicadores en diferentes tratamientos. El color representa el filo de los ASV clasificados y la anotación taxonómica de los ASV fue a nivel de familia.

Después de la caracterización de la comunidad bacteriana y la identificación de taxones de biomarcadores en dos cultivares de arroz, buscamos revelar las posibles funciones ecológicas del microbioma de la rizosfera y la endosfera bajo estrés por Cd. Seleccionamos 12 muestras de ADN del tratamiento control (CK) de estos dos compartimentos para su posterior secuenciación metagenómica. Los resultados indicaron que la comunidad de microbioma de XS14 tenía una mayor diversidad funcional (Kruskal-Wallis; índice de Shannon basado en KO: P <0,001, COG: P <0,001, CAZy: P <0,001 y ResFam: P <0,01, Fig. 5a) en la rizosfera que YY17, sin embargo, no se observaron diferencias significativas en la endosfera. Las composiciones funcionales (ordenaciones NMDS de KO y COG) de la comunidad del microbioma de la rizosfera variaron significativamente de la endosfera, y diferentes cultivares de arroz también tuvieron impactos significativos en las funciones del microbioma de la rizosfera (PERMANOVA, P <0,001, Fig. 5b), pero no en la endosfera. . Para determinar los distintos perfiles funcionales especializados entre dos cultivares de arroz, se realizaron análisis de enriquecimiento diferencial en la abundancia de genes del microbioma. Nuestros datos revelaron que el gen de óxido nítrico reductasa (norB, K04561), el gen de sulfito reductasa (dsrA, K11180) y el transporte y metabolismo de aminoácidos (COG_E) y carbohidratos (COG_G) se enriquecieron en XS14 (Fig. 5c). Mientras tanto, los genes funcionales involucrados en el ciclo de C, N, P y S mostraron patrones significativamente diferentes entre nichos y cultivares de arroz (Fig. 5d). Por ejemplo, los genes funcionales que participaron en la sulfito reductasa (p. ej., dsrA y dsrB) fueron más abundantes en el microbioma de la rizosfera XS14 en comparación con la YY17, mientras que los genes de transporte de fosfato (p. ej., pstA y pstC) se agotaron. En comparación con la rizosfera, los genes funcionales involucrados en el ciclo del carbono (p. Ej., CbbL y cbbS) mostraron un enriquecimiento obvio en la endosfera, especialmente en el microbioma de YY17 (Fig. 5d).

a Comparación de la diversidad funcional basada en los perfiles KO, COG, CAZy y ResFam en el microbioma de la rizosfera y la endosfera. Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para evaluar las diferencias, y las diferencias significativas se indican con un asterisco (**P <0,01, ***P <0,001). b Ordenaciones NMDS basadas en matrices de distancias de Bray-Curtis de KO y COG. Los colores y formas de los símbolos indican los nichos y los cultivares de arroz, respectivamente. Las diferencias de Bray-Curtis fueron probadas mediante PERMANOVA. c Gráfico del volcán que indica el análisis de abundancia diferencial de los perfiles funcionales del microbioma basado en la base de datos KO, COG, CAZy y ResFam de XS14 en comparación con YY17. En los gráficos se etiquetaron varias funciones enriquecidas y agotadas. d Mapa de calor de las abundancias relativas de los genes funcionales implicados en el ciclo de C, N, P y S basado en la base de datos KO. La lista de genes involucrados se proporciona en la Tabla S8.

Para proporcionar información más profunda sobre la capacidad funcional de dos cultivares de arroz en todos los miembros de la comunidad microbiana, luego recuperamos los 25 MAG bacterianos de alta calidad de la combinación metagenómica (Tabla S7). Los resultados ilustraron diferentes patrones de distribución de MAG en la rizosfera y la endosfera de dos cultivares de arroz. Las abundancias de cinco de estos MAG (Meta.bin 110, 97, 373, 299 y 217) fueron significativamente diferentes en la rizosfera, mientras que otros dos de ellos (Meta.bin 217 y 232) fueron notablemente diferentes en la endosfera (Fig. .6a). Es de destacar que los genes del metabolismo del azufre estaban más enriquecidos en Meta.bin.110 y los genes del metabolismo del nitrógeno eran más abundantes en Meta.bin.299, que pertenecían al género DP-20 (filo Desulfobacteria) y Nitrospira (filo Nitrospirota), respectivamente. (Figura 6b). Meta.bin.299 estaba compuesto por 3871 contigs con una longitud total de 3,7 Mb y Meta.bin.110 estaba compuesto por 5630 contigs con una longitud total de 5,8 Mb. Un análisis genómico más detallado de los dos MAG mostró que tenían un gran potencial en el ciclo de nutrientes y el metabolismo de metales pesados ​​(Fig. 6c). El Meta.bin.110 poseía muchas características de ciclo de elementos, como el metabolismo del azufre (p. ej., soxY, dsrA, dsrB, sreB) y el metabolismo del fósforo (p. ej., phoD, pstA, pstC, phoN y phoU) (Fig. 6c; Tabla S8). El Meta.bin.299 tenía múltiples genes beneficiosos para las plantas, como el metabolismo del nitrógeno (p. ej., narG, nirB, nosZ, nirS y norC) y el metabolismo de metales pesados ​​(p. ej., czcABC y ATPasa exportadora de Cd2+) (Fig. 6c; Cuadro S8). Además, cabe señalar que Meta.bin.110 y Meta.bin.299 mostraron una distribución diferente en la rizosfera de dos cultivares de arroz.

La distribución de los genomas ensamblados en metagenoma (MAG) de muestras de rizosfera (a) y endosfera (b). La fuente naranja en negrita indica MAG significativamente enriquecidos o agotados entre dos cultivares de arroz. c Abundancia de genes relacionados con el metabolismo del carbono, el metabolismo de los metales, el metabolismo del nitrógeno, el metabolismo del fosfato y el metabolismo del azufre de los seis MAG. d Genes que codifican el ciclo del nitrógeno, el ciclo del carbono, el ciclo del fósforo, el ciclo del azufre y el metabolismo de los metales en los MAG afiliados a Nitrospirota y Desulfobacteria. La altura de la barra indica la abundancia de genes. Se mostraron diferentes categorías de funciones en diferentes colores.

La contaminación por cadmio en las tierras de cultivo influyó significativamente en la diversidad microbiana del suelo y la seguridad alimentaria [43]. Recientemente, el desarrollo de cultivares de arroz con baja acumulación de Cd se ha convertido en una medida clave para mantener la seguridad alimentaria en suelos contaminados con Cd [44]. Nuestra motivación fue identificar taxones clave que participaron en la tolerancia al Cd y el ciclo de nutrientes, y mejorar la comprensión de los mecanismos específicos del microbioma de baja acumulación de Cd. En este estudio, se comparó el microbioma asociado a las raíces de dos cultivares de arroz que representan capacidades contrastantes de acumulación de Cd (el cultivar XS14 con baja acumulación de Cd y el cultivar de arroz híbrido YY17 que se seleccionó en base a un experimento de campo de 6 años). Aquí, proporcionamos evidencia sólida de que las comunidades bacterianas en el continuo suelo-raíz de dos cultivares de arroz tenían características distintas y revelamos los mecanismos de adaptación de cómo el microbioma en la rizosfera y la endosfera podría haber ayudado al arroz a crecer bajo estrés por Cd (Fig. 7).

El diagrama conceptual que ilustra las estrategias de supervivencia específicas de taxones microbianos de XS14 y YY17 en suelos contaminados con Cd.

Comprender la diversidad y los perfiles funcionales de las comunidades microbianas a lo largo de los nichos del continuo suelo-raíz es crucial para ilustrar los mecanismos de ensamblaje microbiano y su importancia ecológica bajo estrés por Cd. En este estudio, caracterizamos la diversidad y el ensamblaje de la comunidad bacteriana en cuatro nichos asociados a raíces de dos cultivares de arroz y los perfiles funcionales del microbioma en la rizosfera y la endosfera. De acuerdo con informes anteriores [27, 45], los datos de secuenciación de amplicones sugirieron que los nichos del compartimento de la raíz y las aplicaciones de enmienda influyeron fuertemente en la diversidad y las estructuras de la comunidad bacteriana, lo que se confirma por una diversidad alfa en disminución desde el suelo hasta la endosfera (Fig. 2a). . Observamos que la estructura de la comunidad bacteriana (diversidad beta) de dos cultivares de arroz varió significativamente entre cuatro nichos (Fig. 2b), lo que es consistente con las observaciones anteriores de que diferentes cultivares de arroz albergan microbiota distinta que coloniza los nichos asociados a las raíces [46]. La diversidad beta representaba la diferencia de la comunidad y tenía fuertes asociaciones con las funciones microbianas [47]. En particular, encontramos que la comunidad bacteriana de XS14 se procesó relativamente con una mayor disimilitud entre cuatro nichos en comparación con YY17, excepto en el suelo a granel (Fig. 2d), y también se observó una mayor diversidad funcional en el microbioma de XS14 (Fig. 5a). Con base en los resultados anteriores, concluimos que XS14 poseía una comunidad microbiana más compleja y multifuncional en nichos asociados a las raíces. La comparación entre XS14 y YY17 en los parámetros topológicos de la red indicó que la red de XS14 es mucho más compleja y está estrechamente conectada que YY17 en masa y rizosfera (Fig. 3c). En conjunto, nuestros resultados mostraron distintos patrones de coexistencia microbiana entre dos cultivares para hacer frente al estrés por Cd. Esto está respaldado por un estudio reciente que informa que el ecotipo acumulador de Pb (AE) y no acumulador de Pb (NAE) de S.alfredii mostró un reclutamiento distinto de comunidades bacterianas en la rizosfera, donde AE ​​formaba una comunidad más estable y NAE formaba una comunidad más estable. comunidad altamente especializada pero vulnerable [48].

Comprender los mecanismos de ensamblaje de la comunidad microbiana es esencial para avanzar en la investigación de la ecología microbiana en condiciones de contaminación por metales pesados ​​[26]. En nuestro estudio, los procesos deterministas (selección de variables) dominaron los procesos de ensamblaje de dos cultivares de arroz y aumentaron gradualmente a lo largo del continuo suelo-raíz (Fig. 2e). El hecho de que la microbiota a lo largo de nichos continuos asociados a las raíces esté influenciada principalmente por procesos deterministas se ha demostrado en estudios previos [6, 27]. Como se acepta generalmente, desde los suelos hasta el rizoplano y la endosfera, el estrés de selección del huésped aumentó secuencialmente y dio forma a las comunidades bacterianas [11]. Específicamente, nuestros resultados indicaron una firma más fuerte de procesos estocásticos (limitación de dispersión y dispersión homogeneizante) en XS14 en comparación con YY17 (Fig. 2e). La estocasticidad más fuerte en el ensamblaje de la comunidad microbiana indica que los microbios son menos sensibles a las variaciones en las condiciones edáficas [49] y más adaptables a los cambios en el entorno [50], lo que se evidencia por el mayor grado de diversificación funcional en el microbioma asociado a las raíces de XS14. Por lo tanto, es probable que la comunidad bacteriana de XS14 esté más adaptada al suelo contaminado con Cd y desempeñe funciones más críticas en el mantenimiento del crecimiento del arroz bajo estrés por Cd.

El suelo es un "banco de semillas" clave para el microbioma del cultivo y contiene una amplia diversidad de microbiota [51]. Confirmamos que los hábitats del suelo son las principales fuentes de comunidad bacteriana entre cuatro nichos asociados a raíces de dos cultivares de arroz (Fig. S5). Además, se observaron variaciones significativas en los conjuntos de comunidades bacterianas en cuatro nichos asociados a raíces entre dos cultivares de arroz, con algunas especies dentro de la familia Xanthobacteraceae, Bacillaceae, Pseudomonadaceae y Rhizobiaceae (Fig. S4c). Los miembros de Rhizobiaceae y Xanthobacteraceae se identifican como bacterias promotoras del crecimiento de las plantas en la rizosfera [52, 53]. La familia Bacillaceae y Pseudomonadaceae puede promover la asimilación de nutrientes y mejorar la resistencia de los cultivos a las perturbaciones ambientales mediante la producción de aminoácidos [24, 54]. Consistentemente, nuestros análisis metagenómicos indicaron que los genes funcionales relacionados con el transporte y el metabolismo de aminoácidos y carbohidratos estaban enriquecidos en XS14 en comparación con YY17. El aminoácido juega un papel vital en la quelación del Cd, y los carbohidratos son sustancias de almacenamiento de energía para las actividades del organismo que podrían aumentar significativamente bajo estrés por metales pesados ​​[55, 56]. Trabajos anteriores han sugerido que las raíces podrían mejorar el metabolismo de los aminoácidos y los carbohidratos para aliviar la toxicidad del Cd [57]. En conjunto, estos resultados pueden respaldar la idea de que dos cultivares de arroz tienen distintas estrategias de enriquecimiento de funciones específicas en la comunidad microbiana para hacer frente al estrés por Cd.

Recientemente, el análisis de redes y el aprendizaje automático se aplican activamente en la investigación del microbioma para identificar los taxones o funciones clave en la comunidad microbiana [41]. Aquí, construimos redes por separado en cuatro nichos asociados a raíces y realizamos seis modelos de aprendizaje automático para explorar los taxones indicadores clave de dos cultivares de arroz. El análisis de la red indicó que los centros de módulos de dos cultivares de arroz identificados mediante el método Zi-Pi pertenecían principalmente a los filos Proteobacteria, Actinobacteria y Actinobacteria. Mientras tanto, un mayor número de nodos y bordes y más concentradores de módulos en las redes de XS14 sugirieron co-ocurrencias microbianas más complejas en nichos asociados a raíces de XS14, en comparación con YY17 [58]. Debido a la altísima dimensionalidad de los datos del microbioma, diferentes modelos mostraron grandes variaciones en la precisión de la predicción. Random Forest es una técnica de aprendizaje automático supervisada y es adecuada para abordar datos de microbiomas heterogéneos y de alta dimensión [59]. Dado que la comunidad microbiana entre los nichos asociados a las raíces podría verse afectada por muchos factores, como prácticas agronómicas, cambios climáticos y genotipos de huéspedes, fusionamos los datos de nuestro estudio anterior [60] con el fin de aumentar la cantidad de datos y hacer los resultados son más representativos. En este estudio, el análisis de importancia realizado por Random Forest capacitado reveló firmas comunitarias distintas entre cuatro nichos de dos cultivares de arroz. Curiosamente, tanto el modelo de clasificación aleatoria de bosques como el análisis de la red de coocurrencia indicaron que los taxones Nitrospiraceae, Xanthomonadaceae y Mycobacteriaceae (Fig. 4; Tabla S6) fueron los taxones indicadores clave que predicen la capacidad de acumulación de Cd de dos cultivares de arroz. Como se mencionó anteriormente, estos taxones clave desempeñaron diversas funciones ecológicas en nichos asociados a raíces bajo estrés por Cd.

En este estudio, investigamos más a fondo los posibles mecanismos de resistencia al Cd específicos de un taxón que subyacen a la diversa capacidad de acumulación de Cd de dos cultivares de arroz con una alta resolución taxonómica basada en una estrategia de agrupamiento metagenómico. En particular, detectamos que dos MAG clasificados en el género DP-20 (filo Desulfobacteria) y Nitrospira (filo Nitrospirota) eran significativamente más abundantes en XS14 y YY17, respectivamente. Un análisis más detallado de las propiedades del genoma indicó que las funciones relacionadas con el metabolismo del azufre y el metabolismo del nitrógeno se enriquecieron en estos dos MAG, respectivamente. Lo mismo ocurre con estudios anteriores [61], los contenedores afiliados a Nitrospirota contenían una gran abundancia de genes que codifican biomoléculas (o enzimas) para el ciclo del nitrógeno. Esto sugiere una disponibilidad potencialmente mayor de nitrógeno con la contaminación por Cd, como se informó anteriormente [34]. Estudios anteriores también demostraron que las especies pertenecientes a Nitrospirota estaban asociadas con el metabolismo del nitrógeno y tenían mecanismos específicos de resistencia a metales pesados, como la producción de sideróforos, la eliminación de superóxido y la salida de metales pesados ​​[62]. Además, algunos taxones importantes fijadores de nitrógeno pueden contribuir a la fitorremediación al proporcionar nutrientes a las plantas hiperacumuladoras, y se pudo observar una mayor acumulación en los tejidos aéreos [34]. Esto podría explicar por qué los nichos asociados a las raíces de YY17 fueron colonizados por más bacterias asociadas al ciclo del nitrógeno, de modo que se acumuló más Cd en los granos (Fig. S11). Mientras tanto, demostramos que el contenedor afiliado a Desulfobacteria contenía más genes de oxidación y reducción de azufre. Las desulfobacterias muestran preferencia por condiciones anóxicas y se sabe que están relacionadas con el metabolismo del hierro y los procesos de reducción de sulfatos [63]. De hecho, estas bacterias reductoras de sulfato (SRB) pueden producir sulfuro e inmovilizar iones tóxicos como el Cd como precipitación de CdS y, por lo tanto, reducir la biodisponibilidad del Cd en el suelo [64]. Además, dado que todos los genes del metabolismo de los metales se detectaron en dos MAG, es probable que el metabolismo de los metales evolucionado en la microbiota pueda respaldar la supervivencia de XS14 y YY17 en suelos contaminados con Cd.

En conjunto, los hallazgos de este estudio mejoran nuestra comprensión de las distintas estrategias de supervivencia microbianas específicas de taxones de dos cultivares de arroz bajo estrés por cadmio, al identificar las funciones ecológicas de los biomarcadores clave. Los MAG recuperados proporcionaron un profundo conocimiento informativo de las variaciones en los perfiles funcionales relacionados con el crecimiento de las plantas y el metabolismo de los metales pesados ​​de dos cultivares de arroz. Sin embargo, las compensaciones en la cooperación y la competencia entre estos taxones clave no se comprenden completamente y es necesario investigarlas in vitro e in vivo para seguir diseñando comunidades sintéticas para la agricultura sostenible y la seguridad alimentaria bajo contaminación por metales pesados.

Nuestro trabajo investigó las características estructurales y funcionales de los microbiomas asociados a las raíces de dos cultivares de arroz con capacidades contrastantes de acumulación de Cd (arroz bajo en Cd XS14 y arroz híbrido YY17), y reveló distintas estrategias de reclutamiento específicas de taxones y funciones específicas en nichos asociados a las raíces. entre estos dos cultivares. Identificamos miembros de biomarcadores pertenecientes a DP-20 (filo Desulfobacteria) y Nitrospira (filo Nitrospirota) que mostraron un funcionamiento ecológico significativo pero contrastante para mantener las adaptabilidades de supervivencia de XS14 y YY17, respectivamente, a través del metabolismo del azufre en DP-20, y del nitrógeno y el metal. metabolismo en Nitrospira. Nuestro estudio caracteriza metódicamente las variaciones en la acumulación de Cd en granos de dos cultivares de arroz para descifrar los mecanismos de reclutamiento microbiano específicos de la función taxonómica. Nuestros hallazgos resaltan patrones específicos de cultivar de ensamblaje y funcionamiento de comunidades microbianas en el continuo suelo-raíz de dos cultivares de arroz en respuesta al estrés por Cd, y sientan las bases para una posible manipulación de biomarcadores para promover el crecimiento del arroz y la seguridad alimentaria en suelos contaminados con Cd. .

La prueba de campo se llevó a cabo en el condado de Wenling (28°21′ N, 121°15′ E), provincia de Zhejiang (sureste de China), con un clima monzónico subtropical. Los sitios de muestreo y los detalles se describieron en nuestro estudio anterior [60]. Realizamos un experimento de campo consecutivo de 6 años con la aplicación de diversas enmiendas de suelo con dos cultivares de arroz desde 2016, uno es un arroz híbrido (Oryza sativa L., Japonica) llamado Yongyou17 (YY17), el otro es un arroz convencional (Oryza sativa L., Japonica) denominada Xiushui14 (XS14). Con base en los resultados de nuestros estudios anteriores (Fig. S1), en el análisis posterior, definimos XS14 como el cultivar de arroz con bajo contenido de Cd y YY17 como el cultivar de control. El sitio experimental consistió en cinco tratamientos (control, CK; cal, LM; biochar, BC; estiércol de cerdo, PM; acondicionador de suelo comercial, CMC) con un diseño de bloques al azar completo (5 × 4 m para cada parcela) de tres repeticiones ( Figura S2a). El esquema detallado de enmienda y el manejo de la fertilización se describieron en un estudio anterior [60].

La recolección de muestras de suelo y raíces se realizó en la etapa de cosecha de arroz (20 de octubre de 2020), correspondientes a cuatro nichos asociados a las raíces, incluidos el suelo a granel, la rizosfera, el rizoplano y la endosfera, respectivamente. Se recogieron muestras de suelo a granel a una distancia de 10 cm de las raíces de arroz dentro de cada parcela de tratamiento mezclando minuciosamente cinco núcleos de capa superior de suelo al azar (0 a 20 cm), y se recogieron y mezclaron cinco raíces de arroz al azar para formar una muestra de raíz en el Mismo tiempo. La recolección de muestras asociadas a las raíces y el procesamiento de los compartimentos se realizaron como se describió anteriormente [4, 60]. Todas las muestras de suelo y raíces de arroz se almacenaron a -80 ° C antes de la extracción de ADN (Fig. 1a). Se obtuvo un total de 120 muestras de ADN (2 cultivares de arroz × 5 tratamientos × 3 replicados × 4 compartimentos) para el análisis de la comunidad microbiana. Las propiedades fisicoquímicas de las muestras de suelo se midieron como se informó anteriormente [60], incluido el pH del suelo, el nitrógeno orgánico disuelto (DON), el carbono orgánico disuelto (DOC), el nitrógeno total (TN), el carbono total (TC), el fósforo disponible (AP) , nitrógeno nitrato (NO3--N), nitrógeno amónico (NH4+-N), Cd disponible (Cd extraíble con CaCl2) y concentraciones de Cd total en granos de arroz y suelo a granel de dos cultivares de arroz. Los factores de bioacumulación de dos cultivares se calcularon como concentraciones de Cd en granos de arroz/concentraciones totales de Cd en suelos a granel [42].

Todo el ADN genómico se extrajo utilizando el kit FastDNA SPIN para suelo (QBIO gene Inc., Carlsbad, CA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN del suelo a granel y de la rizosfera se extrajo de 0,5 g de suelo fresco, el ADN del suelo del rizoplano se extrajo de 0,2 g de suelo fresco y la muestra de ADN de la endosfera se extrajo de 3 a 5 g de raíces frescas. Los análisis de la comunidad bacteriana entre cuatro nichos se realizaron mediante secuenciación del amplicón del gen 16 S rRNA. La región V4 se amplificó utilizando los pares de cebadores comunes 515 F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') y 806 R (5′-GGACTACHVGGGT-WTCTAAT-3') [31]. Todas las muestras de ADN se secuenciaron en la plataforma Illumina Nova6000 de Guangdong Magigene Biotechnology Co. Ltd. (Guangzhou, China). Las secuencias de cebadores con una puntuación de calidad (Q) inferior a 30 se recortaron y las secuencias de pares finales se unieron mediante el uso del canal Quantitative Insight into Microbial Ecology2 (QIIME2 v. 2020.11) [65]. Los datos de secuenciación de alta calidad se clasificaron en variantes de secuencia de amplicones (ASV) utilizando el canal DADA2 y la asignación taxonómica se realizó utilizando la base de datos Silva (v13.2) (https://www.arb-silva.de/). Antes del análisis posterior, la tabla de ASV se redujo al número más bajo de secuencias en todas las muestras.

Para caracterizar mejor las funciones ecológicas del microbioma de dos cultivares de arroz, se seleccionaron 12 muestras de ADN del tratamiento de control recolectadas de dos cultivares de arroz (tratamiento CK × dos nichos × tres réplicas × dos cultivares) para la secuenciación metagenómica utilizando la plataforma Illumina NovaSeq PE150 (Personal Biotecnología Co., Ltd. Shanghai, China). En total, se obtuvieron 240 Gb de datos sin procesar con aproximadamente 20 Gb por muestra. Las lecturas sin procesar se sometieron a control de calidad y filtrado utilizando FastQC (v0.11.9) y Trimmomatic (v0.39) [66], respectivamente. Luego, las lecturas se asignaron al genoma de referencia del arroz (Oryza sativa L., GCF_000005425.2) y las lecturas mapeadas se eliminaron utilizando Bowtie2 [67]. Los datos limpios restantes se ensamblaron en contigs usando Megahit (v1.2.9, parámetro: –min-contig-len 500 –k-step 20) [68]. En total, recuperamos 19.512.653 contigs con un contenido promedio de GC de 63,43%, N50 de 1011 pb y una longitud total de 8,356 × 109 pb. Todos los contigs de más de 1000 pb se utilizaron para una mayor anotación genética utilizando Prodigal (v2.6.3, parámetro: -p meta) [69], y generaron 5.327.157 marcos de lectura abiertos (ORF) con el 45,1% de los genes identificados como completos. Luego, los ORF se agruparon en un umbral de similitud de 0,95 utilizando CD-HIT (v4.8.1, parámetro: -aS 0,9 -c 0,95 -G 0 -g 0 -T 0 -M 0) [70] para generar un catálogo de genes no redundante. Los perfiles de abundancia de genes se estimaron en transcripciones por millón (TPM) por salmón (v1.3.0, parámetro: –meta) [71]. Se utilizaron los perfiles de ortología (KO) de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) [72], la enzima activa de carbohidratos (CAZyome) [73] y la base de datos de grupos de proteínas ortólogas (COG) [74] para la anotación funcional del microbioma utilizando NOG de huevo (v5.0) [75]. Los genes de resistencia a los antibióticos también se detectaron utilizando la base de datos ResFams [76]. Las diversidades funcionales se calcularon utilizando el software R. El análisis de abundancia funcional diferencial entre XS14 y YY17 se realizó utilizando el enfoque de modelo lineal generalizado (GLM) (método de normalización TMM) en el paquete edgeR (v3.28.1) [77].

La agrupación del genoma se realizó utilizando CONCOCT (v1.0.0), MaxBin (v2.2.6), MetaBAT (v2.12.1) mediante MetaWRAP pipeline (v1.3.2) [78]. DAS_Tool (v1.1.2, parámetro: –search_engine diamante) [79] se utilizó además para seleccionar los mejores genomas ensamblados en metagenoma (MAG) de los tres resultados del software de agrupación. dRep (v3.0.0, parámetro: -sa 0,99 -pa 0,95 -nc 0,3) [80] se utilizó para la desreplicación en todos los contenedores en el umbral del 99% de ANI con al menos un 30% de superposición entre genomas. Se utilizó CheckM (v1.1.3) [81] para evaluar la integridad y la contaminación de los MAG recuperados. Finalmente, obtuvimos 67 MAG que cumplen con el umbral de calidad media (>50% de integridad y <10% de contaminación) y 19 MAG que se estimó como genoma de alta calidad (>90 de integridad y <10% de contaminación) [8] . Luego, solo se seleccionaron 25 MAG con una integridad >80% y una contaminación <10% para análisis adicionales [33]. La abundancia de MAG en las muestras se estimó utilizando MetaWRAP (v1.3.2) [78] con el módulo quant_bins. La taxonomía de los MAG se asignó utilizando GTDB-TK (V1.7.0) [82]. Los ORF se predijeron utilizando Prodigal (v2.6.3) [69] y KofamKOALA [83] realizó la anotación funcional en la base de datos KEGG.

Realizamos seis enfoques de aprendizaje automático para la clasificación, incluida la red neuronal artificial (ANN), el árbol de decisión (DT), el bosque aleatorio (RF), los K vecinos más cercanos (KNN), la regresión logística (LR) y la máquina de vectores de soporte (SVM). con núcleo radial. Los datos de secuenciación del amplicón 16 S rRNA bacteriano de nuestro estudio anterior [60] se integraron para aumentar la cantidad de datos de entrenamiento, incluidos los tratamientos similares de cuatro enmiendas con los mismos cultivares de arroz (XS14 y YY17). En total, se recolectaron 216 muestras bacterianas con 54 muestras por nicho. El conjunto de datos se dividió en dos particiones, una es el conjunto de entrenamiento (70%) y la otra es el conjunto de prueba (30%), siendo el primero usado para entrenar modelos, mientras que el segundo se usó para probar sus habilidades predictivas. Se empleó una validación cruzada quíntuple para evitar el sobreajuste. Brevemente, el conjunto de entrenamiento se separó aleatoriamente en cinco subconjuntos, uno de ellos se usó para la validación y el resto se usó para el entrenamiento, y el proceso se repitió durante cinco iteraciones. Se calcularon las tasas de error promedio de cada modelo para seleccionar el modelo óptimo que pueda dar las predicciones más precisas. El diagrama de flujo de los modelos de clasificación de aprendizaje automático se ilustra en la Fig. 1b. La construcción del preprocesamiento de datos y la predicción del modelo se realizó en el software R.

Calculamos la diversidad alfa microbiana basándonos en la tabla de ASV enrarecidos utilizando el paquete vegano [84]. ANOVA se realizó utilizando la prueba HSD de Tukey para evaluar la significación estadística de comparaciones múltiples. Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para comparar la importancia de las diferencias en la diversidad alfa entre cuatro nichos. Se utilizaron pruebas t de Student (bilaterales) para comparar las diferencias en dos cultivares de arroz. La diversidad beta microbiana se evaluó mediante el cálculo de matrices de distancia de Bray-Curtis y se utilizaron análisis de escalamiento multidimensional no métrico (NMDS) para la ordenación. Se realizaron análisis de varianza multivariados permutacionales (PERMANOVA) basados ​​en matrices de distancias de Bray-Curtis con la función de Adonis para evaluar los efectos de diferentes factores en las comunidades microbianas. También utilizamos el modelo Source Tracker [85] para estimar las fuentes potenciales de comunidades bacterianas en los cuatro nichos. El análisis de enriquecimiento diferencial en la abundancia de genes del microbioma se realizó utilizando el paquete R edgeR. Sólo los genes con P ajustado por FDR <0,05 y log2 (cambio de veces)> 1 o <-1 se consideraron significativamente "enriquecidos" o "agotados", respectivamente [86].

El índice Beta del taxón más cercano (βNTI) se calculó utilizando el modelo nulo (999 aleatorizaciones) para evaluar la importancia relativa del determinismo y la estocasticidad en los procesos de ensamblaje de comunidades bacterianas [87]. Además, se calculó una matriz de Raup-Crick (RCbray) basada en Bray-Curtis para dividir los procesos como: (1) selección homogénea (βNTI > 2), (2) selección variable (βNTI < −2), (3) limitación de dispersión (|βNTI | <2 y RCbray > 0,95), (4) dispersión homogeneizante (|βNTI | <2 y RCbray < −0,95), y (5) no dominado (|βNTI | <2 y |RCbray | < 0,95) [87 ].

El análisis de la red se realizó con base en una matriz de correlación significativa de Spearman y se visualizó utilizando la plataforma Gephi (versión 0.9.2) [88] basada en el algoritmo de Fruchterman Reingold. Para eliminar la influencia de los ASV raros en las redes, nos centramos en los ASV que se detectaron en al menos el 75% de las muestras y con una abundancia relativa> 0,01% [16]. Solo se mantuvieron las correlaciones sólidas (r > 0,7 o r < −0,7) y estadísticamente significativas (ajuste FDR P < 0,05) [89]. Las características topológicas se calcularon utilizando el paquete igraph [90]. Se generaron redes aleatorias con los mismos bordes y nodos, y las propiedades topológicas de las redes aleatorias se calculan según el modelo Erdős-Rényi [91]. La conectividad natural se calculó para revelar la robustez de las redes según el estudio anterior [92]. Brevemente, los nodos se clasificaron por intermediación y luego los eliminamos secuencialmente hasta que se eliminaron el 80% de los nodos, y luego evaluamos la robustez de la red después de eliminar los nodos [93]. También calculamos la conectividad dentro del módulo (Zi) y la conectividad entre módulos (Pi) de acuerdo con el método descrito anteriormente [94]. Los centros de módulos (Zi > 2,5, Pi ≤ 0,62) son nodos altamente conectados dentro de los módulos, que se esperaba que mediaran en las interacciones entre especies dentro de los módulos [58]. Por lo tanto, en este estudio, los centros de módulos se consideran nodos clave. Todos los análisis estadísticos y gráficos se produjeron en el programa R.

Los datos de secuenciación sin procesar se presentaron en el Archivo de secuencias del genoma en el Centro de datos BIG de la Academia de Ciencias de China (http://bigd.big.ac.cn/gsa) con el número de acceso CRA006325 (16 S) y CRA006366 (metagenómico). .

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Este trabajo fue apoyado conjuntamente por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2018YFC1800501), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (42177007, 42225705), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (LGN22D010004) y los Programas de Ciencia y Tecnología del Departamento. de Recursos Naturales de la Provincia de Zhejiang, China (No. 2020006, No. 202045).

Instituto de Recursos Suelos y Aguas y Ciencias Ambientales, Facultad de Ciencias Ambientales y de Recursos, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, 310058, China

Zhongyi Cheng, Jiachun Shi, Yan He, Xueling Yang, Xiaowei Huang y Jianming Xu

Laboratorio provincial clave de recursos agrícolas y medio ambiente de Zhejiang, Hangzhou, 310058, China

Zhongyi Cheng, Jiachun Shi, Yan He, Xueling Yang, Xiaowei Huang y Jianming Xu

Departamento de Matemáticas y Teorías, Laboratorio Peng Cheng, Shenzhen, 518000, China

Qiang Zheng

Departamento de Ciencias Ambientales, Universidad de California, Riverside, CA, 92521, EE. UU.

Laosheng Wu

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ZYC, JCS y YH diseñaron los experimentos. ZYC y JCS realizaron los experimentos. ZYC, XLY y XWH realizaron los experimentos de laboratorio y escribieron el borrador del manuscrito. ZYC y QZ realizaron los procesos de datos. JCS, YH, LSW y JMX revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Jiachun Shi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Cheng, Z., Zheng, Q., Shi, J. et al. Identificación metagenómica y asistida por aprendizaje automático de biomarcadores que impulsan características distintivas de acumulación de Cd en el microbioma asociado a las raíces de dos cultivares de arroz. COMUN ISME. 3, 14 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00213-z

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Recibido: 14 de junio de 2022

Revisado: 03 de enero de 2023

Aceptado: 12 de enero de 2023

Publicado: 22 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00213-z

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